文献解读结合空间转录组与单细胞转录组 [复制链接]

单细胞转录组技术自年首次报道以来，由于其在解析细胞异质性、探索疾病机理方面的突出优势，在生物医学领域得到广泛应用。但测序前的组织解离导致空间信息的丢失，从而限制了我们对肿瘤微环境中细胞相互作用等的理解。而空间转录组技术利用空间寡脱氧胸苷微阵列让分析整个组织切片的空间转录组成为可能。虽然空间转录组技术已经应用到多种组织和肿瘤的研究中，但其局限性仍然不容忽略：达不到单个细胞分辨率，每个成像点能够捕获10-个细胞的转录组。

美国纽约NYULangoneHealth的ItaiYanai团队开发新的算法MIA，结合空间转录组测序技术和单细胞转录组技术研究胰腺导管腺癌组织结构，克服两种技术各自存在的缺陷，相互补充，实现单细胞水平与空间的全面而无偏向性的组织分析。相关论文于年1月13日发表于NatureBiotechnology。

1.scRNA-seq鉴定PDAC中的细胞亚群

IDENTIFYINGCELLPOPULATIONSINPDACWITHscRNA-seq

首先，作者用两名未经治疗患者的新鲜原发性PDAC肿瘤：PDAC-A和PDAC-B，同时进行scRNA-seq和ST分析（图1a）；分别在PDAC-A和PDAC-B肿瘤中鉴定得到了15和11个不同的细胞群，提供了对PDAC肿瘤微环境的深入认识（图1b）；同时发现两组织共有亚群中基因表达谱呈现强相关性，进而验证样本中细胞类型的鉴定结果（图1c）；对于已识别的细胞类型，作者推断染色体扩增和缺失并检测到PDAC-A中的两个细胞群和PDAC-B中的一个细胞群显示异常的CNV谱（图1d,e）；为了进一步验证在scRNA-seq数据中鉴定的TM4SF1和SA4表达群体是否代表癌细胞群体，作者对来自相同患者的福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)进行了TM4SF1和SA4双重免疫荧光染色（图1f）。

图1两例PDAC患者肿瘤的scRNA-seq分析

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2.PDAC的ST分析和MIA算法

STOFPDACTISSUEANDMIA

苏木精和伊红（HE）染色和明场成像后，作者注释了空间切片的不同组织学特征（图2a,b）；在两个样本数据集中，发现许多高可变表达的基因在空间上的表达与注释的组织学区域相匹配（图2c,d）；根据主成分分数对每个ST阵列的点进行聚类后，发现所得聚类与组织学注释一致（图2e,f）；通过提取scRNA-seq和ST模式的基因集，MIA接下来计算每对细胞类型特异性和区域特异性基因集之间的重叠，并执行超几何测试，以评估显著富集或耗尽。如：作者发现PDAC-A中的成纤维细胞特异性基因与ST数据中癌区特异性基因组显著重叠（图2g）；将这种分析扩展到所有细胞类型和肿瘤区域，就产生了“MIA图”。因此，虽然scRNA-seq数据鉴定了成纤维细胞类型，但MIA进一步揭示了这些细胞在癌区富集，而不是间质区（图2h）；PDAC-B样本生成了“MIA图”，导管上皮区域主要富集导管细胞，而胰腺组织富集腺泡细胞和内分泌细胞，（图2i）。

图2PDAC的ST分析和细胞类型注释

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3.跨组织区域的细胞类型亚群的鉴定和定位

IDENTIFICATIONANDMAPPINGOFCELLTYPESUBPOPULATIONSACROSSTISSUEREGIONS

作者从scRNA-seq结果中发现两个肿瘤样本中主要的细胞类型是表达KRT19的导管细胞，进一步细分为4个亚群，一个表达APOL1和缺氧反应相关基因（包括ERO1A和CA9）的导管群；表达TFF1,TFF2和TFF3的末端导管群；表达CRISP3和CFTR的中心腺泡导管群；表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因CD74,HLA-DPA1,HLA-DQA2,HLA-DRA,HLA-DRB1和HLA-DRB5以及补体通路成分C1S,C4A,C4B,CFB和CFH（图3a-d）；作者应用FFPE患者组织进行双重免疫荧光实验证实了它们的存在，发现亚群标记物与导管标记物KRT19共定位（图3e-h）；通过MIA分析，发现PDAC-A中的所有导管细胞亚群都在导管区域中富集，但只有低氧和末端导管细胞亚群在癌细胞区域显着富集，低氧导管细胞亚群在胰腺组织中耗竭。相比之下，PDAC-B中的导管亚群都只富集在导管区域（图3i,j）。

图3跨组织区域导管亚群的MIA图

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4.PDAC组织切片中不同的癌细胞亚群定位

MAPPINGDISTINCTCANCERPOPULATIONSACROSSPDACTISSUESECTIONS

作者对每个组织切片中富含癌症的区域，使用层级聚类将富含癌症的区域进一步划分为转录相关的子区域（图4a-c）。在定义了特定于每个子区域的基因集之后，再次应用MIA映射方法来研究子区域相关的基因集与scRNA-seq数据中为每个细胞类型和亚群定义的基因组之间的重叠，例如：在三个PDAC-A组织切片中一致观察到：成纤维细胞在癌cluster1富集程度高，而在癌cluster2富集程度低或无富集，这表明癌cluster1细胞可能在组织中引起特定的基质反应或者癌cluster2细胞与组织中的成纤维细胞互斥（图4d）。

图4癌症亚区显示不同的细胞类型和亚群富集

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5.肿瘤微环境中细胞状态之间的关系解析

DECONVOLVINGCELLSTATERELATIONSHIPSINTHETUMORMICROENVIRONMENT

作者生成了第三个PDACscRNA-seq数据集，并使用合并的scRNA-seq数据集来定义PDAC癌细胞中的三个基因表达模块（图5a）；为了将MIA应用于研究应激反应的癌细胞状态，作者鉴定了应激模块高表达位点相关的表达基因，首先根据应激反应模块的高表达和低表达来区分两个ST癌spot亚群（图5b）；发现应激模块基因高表达的spot与炎性成纤维细胞存在显著相关性（图5c）；作者将研究数据与TCGA中个PDAC肿瘤组织的转录组数据相结合，发现只有应激反应基因模块与炎性成纤维细胞特征显著相关（图5d）；结合免疫荧光和HE染色，证明炎性成纤维细胞和表达应激反应基因模块的癌细胞之间的关系，同时反映它们之间存在功能相关性（图5e）。

图5利用MIA绘制癌细胞状态和间质亚型之间的关系

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6.结论和意义

CONCLUSIONSIGNIFICANCE

作者应用开发的新算法MIA将空间转录组与单细胞转录组数据进行整合，解决了空间转录组技术无法达到单细胞分辨率、scRNA-seq无法进行空间定位的问题，从而实现了优势互补，揭示了胰腺导管腺癌的组织结构。

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参考文献：MoncadaR,BarkleyD,WagnerF,etal.Integratingmicroarray-basedspatialtranscriptomicsandsingle-cellRNA-seqrevealstissuearchitectureinpancreaticductaladenocarcinomas[J].NatureBiotechnology.

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