肿瘤微环境研究大剖析——肿瘤相关巨噬细胞
肿瘤免疫微环境是肿瘤与宿主免疫系统之间竞争博弈的主战场，肿瘤微环境（TME）中各种细胞之间的相互作用造成免疫细胞具有依赖于TME的双重作用，并决定肿瘤相关免疫反应的结果——即免疫系统对肿瘤细胞的攻击或耐受。
肿瘤内的免疫细胞包括介导适应性免疫反应的细胞（如T细胞、B细胞等），以及介导天然免疫反应的效应细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞等），而肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境研究中最为热门的免疫细胞亚群。越来越多的研究表明TAM具有支持肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等一系列促进肿瘤发展的功能，与肿瘤患者的不良预后呈高度相关性。由不同巨噬细胞表型定义的亚型（M1促炎型和M2型抗炎型），与肿瘤预后的关联也有着广泛的研究，在结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌食管癌、乳腺癌、胰腺癌等癌种中，均有大量研究报道，并证实两个亚型在预后关联上的负相关性。然而如何精准的找出不同组间TAM的表达谱差异、诠释机理并结合现有的免疫疗法，实现冷热肿瘤的转换将成为抗肿瘤治疗的研究新方向。
巨噬细胞广泛分布于各种组织中。通过对不同组间巨噬细胞表达谱的对比，存在于特定组织中的巨噬细胞按其组织位置可分为肝脏中的Kupffer细胞、脑中的小胶质细胞、骨组织中的破骨细胞、肺中的肺泡巨噬细胞、肾脏中的系膜细胞和淋巴中的被膜下巨噬细胞等。不同组织中的巨噬细胞具有不同的转录和表达谱。
根据表型和功能，巨噬细胞可以分为M1(促炎，经典激活的巨噬细胞)和M2(抗炎，交替激活的巨噬细胞)两种主要类型(图1)，此外还发现其他三种巨噬细胞：肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)、CD+巨噬细胞和TCR+巨噬细胞。
截止到目前的认识，TAM具有从M1到M2样表型的特殊过渡期，这意味着它们在整个肿瘤进展过程中不仅仅属于M1或M2样表型。在肿瘤起始的早期阶段，TAM在转移到M2样型之前为M1样表型。此外，必须指出，类似巨噬细胞的M2还被进一步划分为4个子类型，即M2a、b、c和d，不同子类型的标记也不同。
M1和M2型巨噬细胞标志物分类汇总
表面分子：M2型巨噬细胞表达高水平的CD、CD和TGFβR，而M1型巨噬细胞表达高水平的CD40、CD80和CD86。
转录因子：STAT1和STAT3在M1表型中高度激活，STAT6在M2表型中高度激活。IRF3、5和7在M1表型中被激活，而IRF4在M2表型中被激活。
细胞因子和趋化因子：在M1型巨噬细胞检测到TNFα、IL1β和IL12等因子的高表达，在M2型巨噬细胞检测到IL10、ALOX15和CCL18等因子的高表达。在M1型巨噬细胞当中iNOS高表达，在M2型巨噬细胞当中Arginase1高表达。
图1多种巨噬细胞亚群及相关标志物(图片来源：FrontImmunol.May26;6:.)
此外，初级TAM可以通过分泌CCL2、CCL5、CCL7、CXCL8和CXCL12等趋化因子招募单核细胞，在IL4、IL6、IL10、IL13以及TGFβ刺激作用下发生极化，具有类似于M2型巨噬细胞的表型，并分泌多种细胞因子（如TGFβ、IL-10等）和趋化因子(招募Th2和调节性T细胞)，介导免疫抑制效应；分泌多种细胞因子、生长因子(如EGF、VEGF、PDGF、FGF和TGFβ）、基质金属蛋白酶(MMPs)、M-CSF等分子，促进慢性炎症、血管新生、肿瘤侵袭和调节免疫反应(图2)。在这个过程中，TAM通过分泌多种因子与肿瘤微环境多种类型细胞发生相互作用和影响，并进而介导复杂的效应(图3)。
图2TAM在肿瘤微环境相关血管生成、慢性炎症和免疫抑制等进程中发挥多重作用(图片来源：CancerMed.Aug;8(10):-.)
图3TAM对肿瘤微环境当中其他细胞的影响（图片来源：Oncotarget.Jul18;8(29):-.）
用什么方法对肿瘤微环境当中的TAM进行分析和评估呢？
我们通过一篇发表在CancerMicroenviron的研究论文，来介绍一些基础技术。文章中分三步对非小细胞肺癌(NSCLC)患者和非肿瘤患者组织中的TAM进行分析，具体如下：
首先，此研究使用免疫组织化学(IHC)来确定与同一患者的非肿瘤组织相比，非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织当中TAM表型可能发生的表型变化。分别使用CD68（通用巨噬细胞标记）、iNOS（M1）和CD（M2）抗体测定TAM表型。
以上图片来源：CancerMicroenviron.Apr;9(1):1-11.
然后，作者对不同类型NSCLC患者肿瘤组织及非肿瘤组织当中CD68、iNOS及CD阳性染色面积占比进行了统计学分析。结果表明，与非肿瘤组织相比，在所有NSCLC亚型肿瘤组织当中CD68和M2型巨噬细胞标记CD均明显增加(P≤0.)。与之相对，与非肿瘤组织相比，在肺腺癌患者和鳞状癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达降低，显著性分别为P≤0.01及P≤0.05，但大细胞癌患者组织当中M1型巨噬细胞标记iNOS的表达与非肿瘤组织相比无明显差异。
图片来源：CancerMicroenviron.Apr;9(1):1-11.
接下来，作者利用多因子液相芯片技术(Bio-plex)对不同类型NSCLC患者及正常对照血清当中介导Th1型和Th2型免疫反应相关多种细胞因子进行了检测和分析。结果表明，与正常对照相比，只有大细胞肺癌患者血清当中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的水平增加，在其他类型的NSCLC患者当中并未发现明显变化。
以上图片来源：CancerMicroenviron.Apr;9(1):1-11.
非因小结
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)对肿瘤的生长、转移及耐药起着重要调控作用，使得TAM成为抗肿瘤转移治疗的重要靶点。TAM功能的可塑性，使它能够通过响应于肿瘤微环境的信号分子(如细胞因子、药物)而改变自身的功能状态，因此针对TAM的深入研究具有重要的科学意义和临床价值，为肿瘤的治疗开辟新的思路和途径。
非因生物的DSP空间多组学技术可以通过对TAM的精确定位来实现不同空间组定义的巨噬细胞亚群表达谱差异的分析（图4），从而深化科研人员对肿瘤微环境的研究。非因DSP空间多组学技术通过在单张切片上选择合适的兴趣点（RegionofInterest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的重蛋白或＞18,重全转录组的原位表达谱分析，是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境设计的高精度、多维度分析的新一代空间组学技术。目前已经成功开发了针对DSP蛋白组和转录组分析的TAM研究流程，欢迎各位老师前来咨询。
图4示例图：非因生物DSP巨噬细胞荧光染色（CD68）肝癌（左：CD68荧光原位定位结合下游DSP蛋白组策略，右：CD68荧光原位定位结合下游DSP转录组策略）
非因生物凭借在癌症蛋白组学，系统生物学与空间生物学研究中的独特优势，率先搭建了国内第一个空间多组学实验室，同时引入基于DSP技术的空间多组学平台，目前已成功服务近百个客户，与中医院、中山大学肿瘤防治中心、上海交通大医院、医院、医院等几十家机构建立良好的合作关系，拥有大量的项目开发经验、专业的技术支持和强大的生信分析团队，确保一流的技术服务能力和水平。
（该文章部分内容转自ABclonal）